کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC، که قبلا به عنوان کروماتوگرافی مایع مایع فشار بالا نامیده می شود)، تکنیک شیمی تجزیه ای است که برای جداسازی، شناسایی و تعیین هر مولکول در مخلوط استفاده می شود. این به پمپ ها متکی است تا یک حلال مایع تحت فشار حاوی مخلوط نمونه را از طریق یک ستون پر از مواد جاذب جامد عبور دهد. هر مولفه در نمونه چندان متفاوت با مواد جاذب اثر می گذارد و موجب جریان جریان متفاوت برای اجزای مختلف می شود و منجر به جداسازی اجزا می شود. حلالیت های مختلف اجزای نمونه در دو فاز باعث حرکت اجزاء از طریق ستون با سرعت های مختلف و بنابراین جدایی اجزاء می شود. محلول پمپاژ شونده یا فاز متحرک و فاز داخل ستون فاز ثابت نامیده می شود. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC برای تولید (به عنوان مثال در فرآیند تولید محصولات دارویی و بیولوژیکی)، قانونی (به عنوان مثال تشخیص داروهای افزایش عملکرد در ادرار)، تحقیق (به عنوان مثال جداسازی اجزای یک نمونه بیولوژیکی پیچیده یا از ترکیبات شیمیایی مشابه از یکدیگر ) و اهداف پزشکی (به عنوان مثال تعیین سطح ویتامین D در سرم خون) کاربرد دارد. کروماتوگرافی را می توان به عنوان یک فرایند انتقال جرم شامل جذب توصیف کرد. HPLC به پمپ ها متکی است تا یک مایع تحت فشار و یک مخلوط نمونه را از طریق یک ستون پر از جاذب منتقل کند، که منجر به جداسازی اجزای نمونه می شود. مولکول فعال ستون، جاذب، به طور معمول یک ماده گرانول از ذرات جامد (به عنوان مثال سیلیس، پلیمرها و غیره)، اندازه50 میکرومتر است. اجزای مخلوط نمونه از هم جدا می شوند، به این دلیل که در سطوح متفاوتی از تعامل با ذرات جاذب وجود دارد. مایع تحت فشار معمولا مخلوطی از حلالها (به عنوان مثال آب، استونیتریل و / یا متانول) است و به عنوان “فاز متحرک” نامیده می شود. ترکیب و دمای آن نقش مهمی در فرآیند جداسازی با تأثیر بر تعاملات بین اجزای نمونه و جاذب دارد. این تعاملات فیزیکی در طبیعت، مانند هیدروفوب (پراکنده)، دو قطبی دوقطبی و یونی، اغلب ترکیبی هستند.

یک ابزار کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC به طور معمول شامل یک گازگیر، نمونه گیر، پمپ و یک آشکارساز است. نمونه گیر نمونه مخلوط را به جریان فاز متحرک که آن را به ستون حمل می کند ، می آورد. پمپ جریان مورد نظر و ترکیب فاز متحرک را از طریق ستون ارائه می دهد. آشکارساز یک سیگنال متناسب با مقدار مولفه نمونه ای که از ستون ظاهر می شود تولید می کند و از این رو امکان تجزیه و تحلیل کمی  اجزای نمونه را فراهم می کند. یک میکروپروسسور دیجیتال و نرم افزار کاربر ابزار HPLC را کنترل می کند و تجزیه و تحلیل داده ها را ارائه می دهد. برخي مدل هاي پمپ هاي مكانيكي در يك دستگاه HPLC مي توانند چندين حلال را با هم در نسبت هاي در حال تغيير در زمان مخلوط كنند و يك گراديان تركيبي در فاز متحرك توليد كنند. آشکارسازهای مختلف به طور مشترک استفاده می شوند، مانند UV / Vis، آرایه فوتودیود (PDA) یا براساس طیف سنج جرمی. اکثر دستگاه های HPLC همچنین دارای یک کوره ستون هستند که اجازه می دهد تا برای تنظیم درجه حرارت که در آن جداسازی انجام می شود.

آماده سازی فاز متحرک

1. فاز موبایل را با اضافه کردن 400 میلی لیتر استونیتریل به حدود 1.5 لیتر آب خالص شده DI آماده کنید.

2. به محلول 2 میلی لیتر اسید استیک glacial  اضافه کنید.

3. محلول را تا حجم  2.0 لیتر در یک فلاسک حجمی با آب تصفیه شده DI رقیق کنید. محلول حاصل باید PH بین 2.8 تا 3.2 باشد.

4. با اضافه کردن 40٪ هیدروکسید سدیم، با استفاده از دیجیتال PH متر کالیبراسیون، pH را به 4.2 تنظیم کنید.

5. فاز متحرک را از طریق یک فیلتر غشاء Nylon 66  (0.47 میکرومتر) تحت خلاء فیلتر کنید تا محلول را بدون گازکرده و مواد جامد را حذف کنید که می تواند ستون کروماتوگرافی را ببندد. مهم است که فاز متحرک را برون گاز کنید تا از داشتن حباب جلوگیری شود، که می تواند موجب ایجاد void درفاز ثابت در ورودی ستون و یا مسیر آشکارساز، و در نهایت باعث بی ثباتی در جذب UV شود.

ابزار را به این ترتیب روشن کنید: رایانه، پمپ، گازسوز، آشکارساز UV

 ستون را نصب کنید

تزریق دستی نمونه و جمع آوری داده

  1. با استفاده از دستگیره انژکتور در موقعیت load ، به آرامی 100 میکرولیتر محلول را از طریق سپتوم تزریق کنید.
  2. اطمینان حاصل کنید که برنامه جمع آوری داده ها برای جمع آوری داده ها برای زمان کافی تنظیم شده است، که اجازه می دهد تا زمان کافی برای همه پیک  ها از طریق آشکارساز دیده شود.
  3. هنگامی که آماده شروع  هستید، دسته انژکتور را به موقعیت تزریق (که نمونه را به فاز موبایل منتقل می کند) بچرخانید و روی “Start Trial” در برنامه جمع آوری داده های کامپیوتری کلیک کنید.

4. پس از گذشت زمان، جمع آوری داده، فایلی برای ذخیره ارسال می کند. داده ها را با یک نام مناسب ذخیره کنید

5. در پايان هر ران،  با ddH2O شستشو دهید. (روی آیکن “مخلوط کردن” کلیک کنید. هر دو لوله حلال را در ddH2O بگذارید. روی آیکون “faucet on” کلیک کنید. برای اجرای 50٪ A و 50٪ B روی OK ضربه بزنید).

6. به ترتیب، آشکارساز UV، پمپ و دگرساز را خاموش کنید. خروج از نرم افزار

لینک های مفید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.