کلونینگ T یا TA cloning

TA cloning (یا کلونینگ سریع یا کلونینگ T شناخته می شود) یک تکنیک subcloning است که نیاز به استفاده از آنزیم های محدود کننده ندارد و آسانتر و سریعتر از ساب کلونینگ سنتی است. این تکنیک به توانایی آدنین (A) و تیمین (T) (بازهای مکمل) بر روی قطعات DNA مختلف برای هیبریداسیون متکی است که در صورت وجود لیگاز، به هم وصل می شوند. محصولات PCR معمولاً با استفاده از پلیمراز Taq DNA تکثیر می شوند که ترجیحیاً آدنین را به انتهای ۳ ‘محصول اضافه می کنند. چنین درجهای تقویت شده PCR به وکتورهای خطی که دارای برآمدگی های تیمین ۳ ‘مکمل هستند کلون می شوند.

فرآیند انجام TA cloning

ایجاد قطعه درج شونده

قطعه درج شونده به روش PCR و با استفاده از پلیمراز Taq ایجاد می شود. این پلیمراز فاقد فعالیت تصحیح ۳ ‘به ۵’ است و با احتمال زیادی، یک انتهای مجزا ۳’-آدنین را به هر انتهای محصول PCR اضافه می کند. اگر پرایمرهای PCR دارای گوانین در انتهای ۵ باشند بهتر است زیرا این امر احتمال افزودن آدنوزین به انتهای آزاد را توسط پلیمراز Taq DNA به حداکثر می رساند. از پلیمرازهای حرارتی که دارای فعالیت اگزونوکلز ‘۳ تا ۵´ گسترده هستند، نباید استفاده شود زیرا آنها ۳-آدنین آزاد ایجاد نمیکنند.

آماده سازی وکتور

وکتور هدف خطی شده و با یک آنزیم محدود کننده blunt-end یا انتهای صاف برش داده می شود. این بردار سپس با استفاده از ترمینال ترانسفراز و (ddTTP) یا  دیدئوکسی تیمیدین تری فسفات دنباله دار می شوند. استفاده از ddTTP برای اطمینان از افزودن تنها یک باقیمانده T بسیار مهم است. و وکتوردر هر انتهای صاف دارای یک بقایای تیمین آزاد می شود.  تولید کنندگان معمولاً “کیت” TA Cloning را با طیف گسترده ای از وکتورهای آماده که از قبل خطی شده و با یک تیمین آزاد برچسب خورده اند ، می فروشند.

مزایا و معایب

با توجه به اینکه نیازی به آنزیم های محدود کننده به غیر از تولید وکتور خطی نیست ، روش بسیار ساده تر و سریعتر از ساب کلونینگ سنتی است. همچنین نیازی به اضافه کردن سایت های آنزیم های محدودکننده در هنگام طراحی پرایمر نیست و بنابراین می توان از پرایمر های کوتاه تر در صرفه جویی در وقت و هزینه استفاده کرد. علاوه بر این ، در مواردی که هیچ جایگاه آنزیم محدود کننده قابل استفاده برای کلون سازی سنتی وجود ندارد ، از کلونینگ TA اغلب به عنوان جایگزین استفاده می شود. نکته مهم در کلونینگ TA این است که کلونینگ جهت امکان پذیر نیست ، بنابراین ژن ۵۰٪ احتمال کلون شدن در جهت معکوس را دارد.

لینک های مفید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.