روشی برای استخراج DNA پلاسمید از سلولهای باکتریایی تشریح شده است. این روش به اندازه کافی ساده است تا بتواند با استفاده از ژل الکتروفورز ۱۰۰ یا بیشتر کلون در روز آنالیز کند و DNA پلاسمید به اندازه کافی خالص است و توسط آنزیم های محدود کننده قابل هضم است. اصل این روش، دناتوراسیون قلیایی انتخابی از DNA کروموزومی با وزن مولکولی بالا است، در حالی که DNA حلقوی کووالانسی بسته دو رشته باقی می ماند. کنترل pH بدون استفاده از pH متر انجام می شود. پس از خنثی سازی، DNA کروموزومی برای تشکیل لخته نامحلول مجدداً ترکیب می شود و DNA پلاسمید را در مایع رویی قرار می دهد. DNA های پلاسمیدی بزرگ و کوچک با این روش استخراج شده اند.

روش استاندارد

این روش بطور عمده با پلاسمید pBR322 و مشتقات آن در سویه های E.coli HB101 ، RRI و SK 15921 مورد استفاده قرار گرفته است.

۱- کلنی های انتخابی در ۲ و نیم میلی لیتر محیط LB حاوی ۱۰۰ میکروگرم بر میلی لیتر کشت می شوند.

۲ – بعد از ۱۸ ساعت انکوباسیون، ۰٫۵ میلی لیتر از محیط کشت برای استخراج پلاسمید به یک میکروتیوب ۱٫۵ منتقل می شود و باقیمانده بعد از افزودن گلیسرول ۴۰٪ در دمای -۲۰۰ درجه سانتیگراد ذخیره می شود. تمام دستکاری ها در دمای اتاق انجام می شود.

۳- میکروتیوب ها به مدت ۱۵ ثانیه سانتریفیوژ می شوند. ماده رویی با دقت با یک آسپیراتور برداشته می شود و پلت سلولی در ۱۰۰ uL از محلولI کاملاً حل می شود. بعد از ۳۰ دقیقه انکوباسیون در ۰ درجه سانتیگراد ، ۲۰۰ uL از محلول II اضافه می شود و لوله به آرامی ورتکس می شود.

سوسپانسیون باید تقریباً شفاف و کمی ویسکوز باشد.

۴- لوله به مدت ۵ دقیقه در ۰ درجه سانتیگراد نگهداری می شود و سپس ۱۵۰ uL از محلول III اضافه می شود.

۵- محتویات لوله برای چند ثانیه باورتکس آرامی مخلوط می شوند که در طی این مدت پلت DNA تشکیل می شود. این لوله در دمای ۰ درجه سانتیگراد به مدت ۶۰ دقیقه نگهداری می شود که اجازه می دهد بیشتر پروتئین، RNA با وزن مولکولی بالا و DNA کروموزومی رسوب کنند.

۶- سانتریفیوژ به مدت ۵ دقیقه که موجب شفافیت تقریبی سوپرناتانت شود. ۴۰۰ uL از ماده رویی برداشته شده و به یک لوله سانتریفیوژ دوم منتقل می شود.

۷- یک میلی لیتر اتانول سرد اضافه می شود و لوله در دمای ۲۰ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ دقیقه نگه داشته می شود. رسوب توسط سانتریفیوژ به مدت ۲ دقیقه جمع آوری می شود و مایع رویی توسط آسپیراسیون برداشته می شود.

۸- پلت در ۱۰۰ ul از استات سدیم ۰٫۱M و M 0.05 Tris-HCl در (pH 8) حل می شود و با ۲ حجم اتانول سرد مجدداً رسوب دهی شود.

۹- بعد از ۱۰ دقیقه در -۲۰۰ درجه سانتیگراد ، رسوب دوباره مانند گذشته توسط سانتریفیوژ جمع آوری می شود. پلت در uL 40 آب حل می شود و سپس ۱۰ uL از بافر نمونه ۵X اضافه می شود. و در نهایت ۱۰-۲۰ ul برای تجزیه و تحلیل الکتروفورز در ژل آگارز لود می شود.

شرایط و سایر اصلاحات روش

۱٫ CCC-DNA در سایر سلولها با روش فوق با موفقیت استخراج شده است. انکوباسیون دمای اتاق یا ۳۷ درجه سانتیگراد با محلول I ممکن است برای ایجاد اختلال در باسیلوس سابتیلیس لازم باشد. در استخراج قلیایی پروتوپلاست Saccharomyces cerevisiae، باند مربوط به حلقه ۲ p سلولهای مخمر با استفاده از الکتروفورز ژل تشخیص داده شد.

۲٫ نیم میلی لیتر محیط کشت به طور مستقیم در ۱٫۵ میلی لیتر لوله Eppendorf رشد داده شده است. یا کلنی هایی (قطر ۳-۴ میلیمتر) را می توان از سطح یک صفحه آگار جدا کرد و در ۱۰۰ درجه اول محلول I حل کرد.

۳٫ اگر تعداد سلول بسیار کم است ، ممکن است زمان سانتریفیوژ طولانی تر لازم باشد تا پلت به اندازه کافی به دیواره لوله بچسبد یا ۰٫۲ میلی لیتر سلول حامل اضافه شود.

۴- در صورت کم بودن تعداد سلول ، ۲۵ ug tRNA را می توان به عنوان حامل برای کمک رساندن DNA پلاسمید اضافه کرد.