پروتکل عمومی تیتراسیون رتروویروس ها:

روز قبل از آلوده کردن سلول های J2-3T3s را در پلیت 6 خانه کشت می دهیم.

به این خاطر از J2-3T3s استفاده می شود که کلنی های مناسبی می دهند. اجازه می دهیم تا سلول ها به کانفلونسی 20-80 درصد برسد، عفونت برخی از رتروویروس ها بر روی سلول های جوانی مانند3T3 نمی توانند تظاهر کنند.

نکته مهم در تیتراسیون رتروویروس ها:

سلول های هدف باید تقسیم شوند.
کمپلکس ویروسی پروتیئن / RNA نمی تواند وارد هسته شود و باید صبر کنید تا غشاء هسته ای درطی میتوز حل شود.

در روز عفونت:

ابتدا الوده سازی اولیه را انجام دهید و سپس 200 میلی لیتر از سوپرناتانت اولیه را برای تیتراسیون نگه دارید. برای هر تیتراسیون 6 میکروتیوپ که هرکدام حاوی 800 میلی لیتر DMEM است آماده کنید.

برای همه 6 میلی لیتر DMEM + 9mg/ml polybrene آماده کنید.

به عنوان مثال اگر 3 تيتر را انجام دهيد، 18 ميليمتر (20 ميلي ليتر) آماده کنید. Polybrene(هگزاديمترين بروميداست )، شما در نهایت از 6mg/mlpolybrene3 میلی گرم در میلی لیتر در PBSبرای ذخیره در دمای 4 درجه سانتیگراد نیاز دارید.

200 میلی لیتراز سوپرناتانت را به Eppendorf No.1 اضافه کنید و با چند بار معکوس کردن مخلوط کنید. و سپس 200 میلی لیتر از اپندورف 1 را به 2 منقل کنید و مخلوط کنید. برای 6 میکروتیوپ تکرار کنید.

0.5 میلی لیتر از سلول در هر ول که با DMEM است را به هر کدام از میکروتیوپ ها اضافه کنید.

روز بعد کلنی ها را بررسی کنید.

انتخاب J2-3T3s

G418 ، 600mg/ml درDMEM حدود یک هفته تا حصول نتیجه زمان می برد.

Puromycin12mg/mlدر DMEM ممکن ست چند روز به طول ببیانجامد.