الکتروفورز Laemelli SDS-PAGE

علمی و آموزشی
/
neb
/
بدون دیدگاه
اشتراک گذاری

Laemmli SDS PAGE
الکتروفورز – برای جداسازی پروتئین با وزن مولکولی نسبی بالاتر از 10 KD استفاده می شود. پروتئین های بسیار کوچک (کمتر از 10 KD) به علت توانایی کم اتصال به SDS، از طریق ژل های گرادیان یا با استفاده از شرایط مختلف الکتروفورز مثل Tricine-SDS-page جداسازی می شوند.

الکتروفورز Laemelli SDS-PAGE برای جداسازی پروتئین با وزن مولکولی نسبی بالاتر از 10 KD استفاده می شود. پروتئین های بسیار کوچک (کمتر از 10 KD) به علت توانایی کم اتصال به SDS، از طریق ژل های گرادیان یا با استفاده از شرایط مختلف الکتروفورز مثل Tricine-SDS-page جداسازی می شوند.

  1. محلول ها را بر اساس جدول زیر تهیه کرده و شیشه های الکتروفورز را اماده می کنیم.
  2. Aps و TEMED محلول را بین دو شیشه تا 1 سانتی متر پایین تر ازشانه ریخته و روی آن متانول میریزیم.
  3. 5% را بین دو شیشه میریزیم.
  4. x به غلظت نهایی 1x تهیه شد و به‌آرامی ورتکس شد(بتا مرکاپتو اتانول احیاکننده پیوندهای دی سولفیدی بوده و به خطی شدن پروتئین حاوی سیستئین کمک می‌کند).
  5. °C 95درون بن­ماری قرار داده شد.
  6. RPM سانترفیوژ شد و رسوب باکتری تهیه گردید.
  7.  μl50 درون چاهک تزریق گردید.

جدول – مقادیر موردنیاز برای آماده کردن ژل SDS-PAGE

5% 15% 15% 14% 14%
6.6 5/7 9.3 6/59 10/58 8/23 13/2 H2O
1.7 12/5 20 11/6 18/6 10 16 Acrylamide mix(30%)
– 6/3 10 6/3 10 6/3 10 Tris 1.5 M –PH=8.8
1.5 – – – – – – Tris 1M-PH=6.8
0.1 0.25 0.4 0.25 0.4 0.25 0.4 SDS 10%
0.1 0.25 0.4 0.25 0.4 0.25 0.4 APS 10%
0.01 0/010 0.016 0/010 0.016 0/010 0.016 TEMED
10 25 40 25 40 25 40 Total
مقدار مواد موردنیاز برای تهیه الکتروفورز بافر1x
3 gr Tris
14.4 gr Glycine
1 gr SDS
1 L ddHH2O
مقدار مواد موردنیاز برای تهیه لودینگ بافر X5
250 mM (PH:6.8) Tris-HCL
10% SDS
50% Glycerol
0.5% Bromophenol-blue
25mM b-mercapto ethanol(2ME)
10mL Total

روش رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلو

پس ازخارج کردن ژل از  دستگاه الکتروفورز درون محلول رنگ آمیزی گذاشته شد وبه مدت 45 دقیقه روی شیکر قرار گرفت. پس از اتمام رنگ آمیزی ژل با آب مقطر شسته شد مرحله رنگ بری طی دو مرحله 45 دقیقه ای با حجم 100 میلی لیتر رنگ بر روی شیکر انجام گرفت. پس از شفاف شدن زمینه ژل ، ژل با آب مقطر شسته و از ژل عکسبرداری شد.

مواد مورد نیاز محلول رنگ آمیزی ژل محلول رنگ بری ژل
کوماسی بلو R250 50 میلی گرم –
متانول خالص 45 میلی لیتر 45 میلی لیتر
آب مقطر 45 میلی لیتر 45 میلی لیتر
اسید استیک (گلاسیال) 10 میلی لیتر 10 میلی لیتر
حجم نهایی 100 میلی لیتر

100 میلی لیتر

 

لینک های مفید

 

برچسب ها:

« کلون سازی مولکولی کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC »

مطالب مرتبط

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *